蘄蛇是蝰科動(dòng)物五步蛇的干燥體，具有祛風(fēng)、通絡(luò)、止痙的功效。近年來(lái)，由于資源有限，價(jià)格昂貴，出現(xiàn)了用其他蛇冒充蘄蛇或在蘄蛇體內(nèi)摻假的現(xiàn)象，因此近些年的《中國(guó)藥典》中蘄蛇鑒定方法改為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR法）。前段時(shí)間江西百仁中藥找到了我們，想讓我們?cè)O(shè)計(jì)一套方案來(lái)鑒定蘄蛇的真?zhèn)?，并寄?lái)了一些蘄蛇測(cè)試樣本。現(xiàn)在我們把鑒定真?zhèn)翁I蛇的方法分享給大家。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/span>

提取蘄蛇樣本中的DNA，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法（PCR法）對(duì)蘄蛇進(jìn)行真?zhèn)舞b定。

二、實(shí)驗(yàn)材料：

1. 蘄蛇待檢樣品（曬干的蛇肉）和陽(yáng)性對(duì)照品（粉末狀）

2. 動(dòng)物組織DNA試劑盒（Simgen Cat.No.3101050）

3. 2×Taq plus PCR Master Mix（Simgen Cat.No.7005100）

4. 蘄蛇特異性引物（F:5’-GGCAATTCACTACACAGCCAACATCAACT-3’ /R:5’-CCATAGTCAGGTGGTTAGTGATAC-3’）

5. 超微量電子天平（DENVER INSTRUMENT，TP-213）

6. 電子恒溫不銹鋼水浴鍋（上海宜昌儀器紗篩廠）

7. 旋渦震蕩器（越新儀器，XH-C）

8. 臺(tái)式離心機(jī)（eppendorf Centrifuge 5415 D）

9. 超微量分光光度計(jì)（SIMGEN Cat.No.sim100）

10. 電泳儀（北京六一儀器廠，DYY-6C型 ）

11. PCR儀（Techne FPROGO5Y Progene Thermal）

三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

本次實(shí)驗(yàn)使用Simgen動(dòng)物組織DNA試劑盒提取蘄蛇樣本DNA，再用Simgen 2×Taq plus PCR Master Mix擴(kuò)增提取的DNA，具體步驟如下：

1. 用手術(shù)刀從待檢樣本上刮下一些組織粉末，稱取25 mg，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中。

2. 加入20 μl蛋白酶K貯存液，再加入180 μl的Buffer AT。

3. 56℃水浴3小時(shí)（因?yàn)闃颖疽呀?jīng)曬制成干，較難溶解），期間旋渦震蕩數(shù)次幫助組織溶解。

4. 加入200 μl Buffer SL，旋渦震蕩約15秒混勻。將離心管置于70℃水浴10分鐘。

5. 12000 rpm離心1分鐘，吸取上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)1.5 ml離心管中，加入200 μl無(wú)水乙醇，旋渦震蕩約15秒混合均勻。

6. 將溶液加入到核酸純化柱中，12000 rpm離心30秒棄濾液。

7. 加入500 μl Buffer WA，12000 rpm離心30秒棄濾液。

8. 加入600 μl Buffer WB，12000 rpm離心30秒棄濾液。

9. 14000 rpm離心1分鐘去除殘留液體。

10. 將核酸純化柱置于一個(gè)潔凈的1.5 ml離心管中，加入100 μl Buffer TE，室溫靜置1分鐘。

11. 12000 rpm離心30秒洗脫得DNA。

12. 在超微量分光光度計(jì)上測(cè)量提取到的DNA的濃度。

13. 用2×Taq Plus PCR Master Mix擴(kuò)增蘄蛇特異性引物，配置體系如下表：

14. PCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為；95℃預(yù)變性5 min，循環(huán)反應(yīng)35次（95℃ 30s,63℃ 45s），延伸（72℃）5分鐘。

15. 對(duì)提取到的DNA和PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。

四、實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1. 在超微量分光光度計(jì)上用試劑盒中的Buffer TE調(diào)零，測(cè)量提取好的DNA，結(jié)果如下：

樣品編號(hào)1、2為陽(yáng)性對(duì)照樣品提取的DNA；

樣品編號(hào)3、4為待檢蛇肉樣品提取的DNA。

2. 在3%的瓊脂糖凝膠上，加入5 μl提取到的DNA和擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳30 min，結(jié)果如下：

五、實(shí)驗(yàn)討論與分析 

1. 從超微量分光光度計(jì)濃度測(cè)量結(jié)果上分析，不管是陽(yáng)性對(duì)照還是待檢蛇肉樣本提取到的DNA濃度都不高，只有一管待檢蛇肉樣本（3號(hào)樣本）提取的DNA濃度稍高一些。推測(cè)可能是蘄蛇在風(fēng)干或制成粉末的過(guò)程中降解了DNA，導(dǎo)致最后提取到的DNA量較少。

2. 從電泳圖分析，陽(yáng)性對(duì)照和待檢蛇肉樣本提取的DNA都看不到明顯的條帶，只有一管待檢蛇肉樣本（3號(hào)樣本）提取的DNA能隱約看到較暗淡的基因組DNA條帶，與測(cè)得的DNA濃度結(jié)果有對(duì)應(yīng)關(guān)系。

3. 雖然提取到的DNA濃度低，但并不影響PCR擴(kuò)增，陽(yáng)性對(duì)照和待檢蛇肉樣本提取的DNA均成功擴(kuò)增出了條帶，且兩者位置一致，證明待檢蛇肉樣本確實(shí)是蘄蛇。

4. 本次PCR擴(kuò)增中，由于DNA濃度低，相應(yīng)的增加了模板DNA的用量，達(dá)到了15 μl。如此高的模板用量，PCR擴(kuò)增卻沒(méi)有受到影響，說(shuō)明了動(dòng)物組織DNA試劑盒提取的DNA潔凈度高，抑制物少。