最近收到客戶反饋“正常挑單菌培養(yǎng)的DH5α質粒菌提取的質粒濃度突然變的好低，是不是試劑盒配方有改動？”。Simgen作為通過ISO質量體系認證的生產企業(yè)，試劑配方若有變動，研發(fā)部、質量部、生產部、銷售部都會收到文件通知。既然沒有相關的文件通知，我們就向客戶索要了培養(yǎng)好的質粒菌（K3-1、K3-22）及使用的試劑盒，并使用公司自己培養(yǎng)的質粒菌（Simgen-1、Simgen-2）進行測試對照。

材料與方法：

Singen實驗室質粒菌培養(yǎng)方法：挑取單菌落到10 ml的LB液體（100 μg/ml氨芐濃度）培養(yǎng)基中，37℃、180 rpm過夜培養(yǎng)約16小時。每管收集2 ml菌液。

客戶培養(yǎng)好的質粒菌（K3-1、K3-22）：每管收集2 ml菌液。

試劑盒：客戶實驗室?guī)Щ氐?/span>Simgen快速質粒DNA小量試劑盒，產品批號：20240429

測試方法：按說明書操作步驟提取質粒DNA后測質粒DNA濃度，并電泳觀察DNA帶型。

測試結果：

質粒提取濃度如下：

1：K3-1；2：K3-22；3：Simgen-1；4：Simgen-2；M：DL2000-G DNA Ladder（Simgen. Cat. No. MD1006-G）。1%瓊脂糖凝膠電泳，120 V 30 min。1和2電泳上樣量均為20 μl，3和4上樣量為1 μl。

討論與分析：

1） 從分光光度計測得的數據分析： Simgen兩管質粒菌提取濃度及數值均在正常范圍內，客戶提供的質粒菌提取的質粒DNA濃度明顯偏低，與客戶描述相符。

2） 電泳結果分析：Simgen-1、Simgen-2質粒DNA條帶正常；K3-1、K3-22提取到質粒，只有marker最上方基因組條帶對應位置有暗淡的條帶，說明沒有提取到質粒，樣本濃度顯示的應該是提取到的微量基因組DNA的濃度。

由于客戶給的菌液完全沒有提取到質粒，詢問客戶后得知這兩種質粒都是氨芐抗性的，于是我們將剩余的兩種菌液在氨芐抗性平板上劃線，過夜培養(yǎng)后重新挑單菌于3 ml LB培養(yǎng)基（100 μg/ml氨芐濃度）中培養(yǎng)7小時。收集1 ml菌液中的菌體重新進行質粒提取，特別仔細觀察并記錄了實驗現象。發(fā)現有以下現象不正常：加入Buffer Ⅱ顛倒數次，液體顯示有少許粘稠但未呈現透明狀，相反呈現混濁狀。加入Buffer N8顛倒數次，黃色的沉淀無法皺縮，始終呈水泡狀，離心沉淀無法完全沉到底部，將上層較少的上清液加入核酸純化柱，繼續(xù)后續(xù)操作，提取濃度如下：

將提取的質粒進行電泳，同樣顯示沒有提取到質粒。

K3-1、K3-22、M：DL5000。1%瓊脂糖凝膠電泳，120 V 30 min。1和2電泳上樣量均為20 μl。

結論如下：

1) 該菌能在含有氨芐青霉素的的平板上正常生長并形成單菌落，但是不能被Buffer II 試劑溶解（注意：正常的大腸桿菌能被Buffer II試劑溶解，菌體溶解后呈透明狀）。

2) 對比菌的生長速度，該菌1 ml菌液離心獲得的菌體沉淀大小相當于5 ml 大腸桿菌菌液獲得的菌體沉淀大小，推測該菌生長速度較快或是單個菌菌體的體積較大所導致。

3) 對比了菌液氣味，發(fā)現該菌液的氣味與同步培養(yǎng)的DH5α宿主菌的質粒菌液氣味明顯不同，該菌有類似酵母菌生長的氣味。

綜上所述，我們判斷在平板上生長的不是含質粒的大腸桿菌，而是真菌?？紤]到加入Buffer Ⅱ后溶液有稍微變粘稠狀，也不排除平板中的單菌落是由真菌和不含質粒的大腸桿菌混合而成的菌落的可能性，解釋為由于真菌不懼抗生素菌落長得較大，無質粒的大腸桿菌在有抗生素的平板中無法單獨形成菌落，只能隱藏在真菌菌落中。

后續(xù)我們特別走訪了客戶的實驗室，并現場與客戶溝通，發(fā)現客戶的質粒轉化和涂平板的實驗沒有在超凈臺進行無菌操作，而是在實驗室內直接操作的。因此我們大致可以推測可能是室內的真菌污染了轉化質粒的平板。需要注意的是大部份的抗生素作用機理是根據真核細胞和原核細胞的結構差異來抑制或殺滅細菌的，所以很多抗生素對酵母菌等真菌無效。以氨芐青霉素為例，其作用靶點是細菌細胞壁的合成過程，真菌與細菌的細胞壁結構完全不同，因此氨芐青霉素對真菌的生長抑制無效。

所以最后我們總結一下：分子生物學中的轉化實驗、接種實驗在實驗條件具備的前提下，必須在無菌的超凈臺中，靠近酒精燈火焰周圍進行操作。若無超凈工作臺，則實驗必須在點燃的酒精燈火焰的5~10 cm周圍處進行轉化或涂布以及接種等實驗。

本次的實驗探索也讓我們了解到一個現象：即便我們從不含質粒的菌液中提取質粒DNA，也是能測到一定的DNA濃度的，只是濃度嚴重偏低。這是因為在質粒DNA的提取過程中，并不是完全沒有細菌的基因組DNA和RNA殘留的，分光光度計顯示的DNA濃度就是這些殘留的細菌基因組DNA和RNA的濃度。當提高提取到的DNA的電泳上樣量后，就可觀察到暗淡的基因組條帶（RNA由于片段太小，一般情況下觀察不到）。正因如此，同學們在提取質粒DNA的時候，如果發(fā)現質粒DNA濃度嚴重偏低，不要簡單地判斷細菌長得不好，或者試劑盒的質量問題，一定要將提取的質粒DNA進行電泳驗證，否則就可能離真相越來越遠。